10 фатальных проблем ПЦР теста на скотский-идентификатор под сокращенным названием COW-ID

ПЦР тест Дростена - полное фуфло! 22 учёных со всего мира доказали это!

Внешняя экспертная оценка теста RTPCR для обнаружения SARS-CoV-2 выявляет 10 основных научных недостатков на молекулярном и методологическом уровне: последствия ложноположительных результатов.

АННОТАЦИЯ

В публикации под названием «Обнаружение нового коронавируса 2019 года (2019-nCoV) с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени» (Eurosurveillance 25 (8) 2020) авторы представляют рабочий процесс диагностики и протокол ОТ-КПЦР для обнаружения и диагностики 2019-nCoV. (теперь известный как SARS-CoV-2), который, по их утверждениям, прошел валидацию, а также является надежной диагностической методологией для использования в лабораторных условиях общественного здравоохранения.

В свете всех последствий, вытекающих из этой публикации для обществ во всем мире, группа независимых исследователей выполнила поэтапный обзор вышеупомянутой публикации, в котором: 1) все компоненты представленного дизайна теста были перепроверены, 2) Рекомендации протокола RT-qPCR были оценены с учетом надлежащей лабораторной практики, а 3) параметры были изучены по соответствующей научной литературе, охватывающей эту область.

Опубликованный протокол RT-qPCR для обнаружения и диагностики 2019-nCoV и рукопись страдают многочисленными техническими и научными ошибками, включая недостаточный дизайн праймеров, проблемный и недостаточный протокол RT-qPCR и отсутствие точной проверки теста. Ни представленный тест, ни сама рукопись не отвечают требованиям для приемлемой научной публикации. Далее не упоминаются серьезные конфликты интересов авторов. Наконец, очень короткий промежуток времени между подачей и принятием публикации (24 часа) означает, что систематический процесс рецензирования здесь либо не проводился, либо имел проблематичное низкое качество. Мы предоставляем неопровержимые доказательства ряда научных несоответствий, ошибок и недостатков.

Учитывая представленные здесь научные и методологические недостатки, мы уверены, что у редакции Eurosurveillance нет другого выбора, кроме как отозвать публикацию.


КРАТКО О ДАННОМ ОБЗОРЕ

В этой статье будут показаны многочисленные серьезные недостатки в статье Кормана-Дростена, значимость которых привела к ошибочной диагностике инфекций, приписываемых SARS-CoV-2 и связанных с заболеванием COVID-19, во всем мире. Мы сталкиваемся с жесткими ограничениями, которые разрушили жизни и средства к существованию многих людей, ограниченным доступом к образованию, и эти ограничения, введенные правительствами по всему миру, являются прямым нападением на основные права людей и их личные свободы, что приводит к сопутствующему ущербу для экономики целых стран. мировой масштаб.

В статье Кормана-Дростена есть десять фатальных проблем, которые мы опишем и объясним более подробно в следующих разделах.
Первая и основная проблема заключается в том, что новый коронавирус SARS-CoV-2 (в публикации под названием 2019-nCoV и в феврале 2020 года названный международным консорциумом вирусных экспертов SARS-CoV-2) основан на in silico (теоретических) последовательностях , предоставленный лабораторией в Китае [1], поскольку в то время авторам не было доступно ни контрольный материал инфекционного («живого») или инактивированного SARS-CoV-2, ни выделенной геномной РНК вируса. На сегодняшний день авторство не провело валидацию на основе изолированных вирусов SARS-CoV-2 или их полноразмерной РНК. Согласно Корману и др .:
«Мы стремились разработать и внедрить надежную диагностическую методологию для использования в лабораторных условиях общественного здравоохранения без наличия вирусного материала». [1]

Здесь следует сосредоточить внимание на двух заявленных целях: а) разработке и б) развертывании диагностического теста для использования в лабораторных условиях общественного здравоохранения.

Эти цели недостижимы без наличия фактического вирусного материала (например, для определения инфекционной вирусной нагрузки). В любом случае только протокол с максимальной точностью может быть обязательной и основной целью в любом сценарии-исходе такого масштаба. Определение критической вирусной нагрузки является обязательной информацией, и Кристиан Дростен несет ответственность за выполнение этих экспериментов и предоставление важных данных.

Тем не менее, эти последовательности in silico были использованы для разработки методики тестирования ОТ-ПЦР для идентификации вышеупомянутого вируса. Эта модель была основана на предположении, что новый вирус очень похож на SARS-CoV 2003 года, поскольку оба являются бета-коронавирусами.

Поэтому тест ПЦР был разработан с использованием геномной последовательности SARS-CoV в качестве контрольного материала для компонента Sarbeco; мы знаем это из нашего личного электронного сообщения [2], одного из соавторов статьи Кормана-Дростена. Этот метод моделирования SARS-CoV-2 был описан в статье Кормана-Дростена следующим образом:

«Создание и проверка диагностического рабочего процесса для скрининга на 2019-nCoV и специального подтверждения, разработанного в отсутствие доступных вирусных изолятов или оригинальных образцов пациентов. Дизайн и валидация стали возможными благодаря тесному генетическому родству с SARS-CoV 2003 года и использованию технологии синтетических нуклеиновых кислот».

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) - важная биомолекулярная технология для быстрого обнаружения редких фрагментов РНК, о которых известно заранее. На первом этапе молекулы РНК, присутствующие в образце, подвергаются обратной транскрипции с образованием кДНК. Затем кДНК амплифицируют в ходе полимеразной цепной реакции с использованием конкретной пары праймеров и термостабильного фермента ДНК-полимеразы. Технология очень чувствительна, и ее предел обнаружения теоретически составляет 1 молекулу кДНК. На специфичность ПЦР сильно влияют ошибки биомолекулярного дизайна.
Что важно при разработке теста RT-PCR и количественного теста RT-qPCR, описанных в публикации Кормана-Дростена?

1. Праймеры и зонды:

a) концентрация праймеров и зондов должна быть оптимального диапазона
(100-200 нМ)
b) должна быть специфичной для целевого гена, который вы хотите амплифицировать
c) должна иметь оптимальный процент содержания GC относительно общего количества азотистых оснований ( минимум 40%, максимум 60%)
г) для диагностики вирусов минимум 3 пары праймеров должны обнаруживать 3 вирусных гена (желательно как можно дальше друг от друга в вирусном геноме)

2. Температура, при которой происходят все реакции:

a) температура плавления ДНК (> 92 °)
b) температура амплификации ДНК (специфическая для TaqPol)
c) Tm; температура отжига (температура, при которой праймеры и зонды достигают целевого связывания / отсоединения, не должна превышать 2 ° C на пару праймеров). Tm сильно зависит от содержания GC в праймерах.
3. Количество циклов амплификации (менее 35, предпочтительно 25-30 циклов);

В случае обнаружения вируса более 35 циклов обнаруживают только сигналы, которые не коррелируют с инфекционным вирусом, как определено путем выделения в культуре клеток [обзор в 2]; если кто-то получил положительный результат с помощью ПЦР при использовании порога 35 циклов или выше (как в большинстве лабораторий в Европе и США), вероятность того, что этот человек действительно инфицирован, составляет менее 3%, вероятность того, что указанный результат является ложноположительным - 97% [обзор в 3]

4. Молекулярно-биологические подтверждения; амплифицированные продукты ПЦР должны быть проверены либо путем прогона продуктов в геле с линейкой ДНК, либо путем прямого секвенирования ДНК.

5. Следует указать положительный и отрицательный контроли для подтверждения / опровержения обнаружения конкретного вируса.
6. Должна быть доступна Стандартная операционная процедура (СОП).

В СОП однозначно указаны вышеуказанные параметры, поэтому все лаборатории могут установить одинаковые условия испытаний. Наличие утвержденной универсальной СОП очень важно, поскольку она позволяет сравнивать данные внутри стран и между странами.
Незначительные проблемы с бумагой CORMAN-DROSTEN

1. В таблице 1 статьи Кормана-Дростена указаны различные сокращения - указано «нМ», «нм» - нет. Далее, что касается правильной номенклатуры, нм означает «нанометр», поэтому здесь нм следует читать нМ.

2. По общему мнению, генетические последовательности всегда должны записываться в направлении 5'-3 ', включая обратные праймеры. Очень необычно выполнять выравнивание с обратной комплементарной записью последовательности праймера, как это сделали авторы на рисунке 2 статьи Кормана-Дростена. Здесь, кроме того, база колебания помечена как «y» без описания оснований, которые обозначает Y.

3. Две вводящие в заблуждение ошибки в работе Кормана-Дростена заключаются в том, что их таблица 1 не включает Tm-значения (значения температуры отжига), а также не показывает GC-значения (количество G и C в последовательностях как% -значение от всего баз).

ОСНОВНЫЕ ПРОБЛЕМЫ С РУКОПИСЬЮ КОРМАН-ДРОСТЕН

Подоплёка

Авторы представляют предысторию своей научной работы следующим образом: «Продолжающаяся вспышка недавно возникшего нового коронавируса (2019-nCoV) представляет собой проблему для лабораторий общественного здравоохранения, поскольку изоляты вируса недоступны, в то время как появляется все больше свидетельств того, что вспышка более распространена, чем изначально думали, а международное распространение.

Б) МЕТОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Праймер и конструкция зонда
1a) Ошибочные концентрации праймера

Надежные и точные протоколы тестирования ПЦР обычно разрабатываются с использованием 100 до 200 нМ на праймер [7]. В статье Кормана-Дростен мы наблюдаем необычно высокие и разные концентрации праймеров для нескольких праймеров (таблица 1). Для пар праймеров RdRp_SARSr-F и RdRp_SARSr-R описаны 600 нМ и 800 нМ соответственно. Точно так же для набора праймеров N_Sarbeco_F и N_Sarbeco_R они рекомендуют 600 нМ и 800 нМ соответственно [1].

Должно быть ясно, что эти концентрации слишком высоки, чтобы быть оптимальными для конкретных амплификаций генов-мишеней. В этом протоколе нет конкретной причины использовать эти чрезвычайно высокие концентрации праймеров. Скорее, эти концентрации приводят к усилению неспецифического связывания и амплификации продукта ПЦР.



Таблица 1: Праймеры и зонды (адаптировано из статьи Кормана-Дростена; ошибочные концентрации праймеров выделены)

1b) Неуказанные («шаткие») последовательности праймеров и зондов.

Для получения воспроизводимых и сопоставимых результатов важно четко определить пары праймеров. В статье Кормана-Дростена мы наблюдали шесть неуказанных положений, обозначенных буквами R, W, M и S (Таблица 2). Буква W означает, что в этой позиции может быть либо A, либо T; R означает, что может быть либо G, либо A; M указывает, что позиция может быть A или C; буква S указывает на то, что на этой позиции может быть буква G или C.

Такое большое количество вариантов не только необычно, но и сбивает с толку лаборатории. Эти шесть неуказанных положений могут легко привести к созданию нескольких различных альтернативных последовательностей праймеров, которые не относятся к SARS-CoV-2 (2 различных праймера RdRp_SARSr_F + 8 различных зондов RdRp_SARS_P1 + 4 различных RdRp_SARSr_R).Изменения конструкции неизбежно приведут к результатам, даже не связанным с SARS CoV-2. Следовательно, сбивающее с толку неспецифическое описание в статье Кормана-Дростена не подходит в качестве стандартного рабочего протокола. Эти неуказанные позиции должны были быть разработаны недвусмысленно.

Эти шаткие последовательности уже вызвали беспокойство в этой области и привели к письму в редакцию, написанному Pillonel et al. [8] относительно явных ошибок в описанных последовательностях. Эти ошибки очевидны в Corman et al. добавка

Протокол ВОЗ (рис. 1), который непосредственно заимствован из статьи Кормана-Дростена, заключает, что для подтверждения наличия SARS-CoV-2 необходимо идентифицировать два контрольных гена (E- и RdRp-гены). в пробирке. Следует отметить, что ген RdPd имеет одно неопределенное положение («шаткое») в прямом праймере (R = G / A), два неопределенных положения в обратном праймере (R = G / A; S = G / C) и он имеет три неопределенных положения в датчике RdRp (W = A / T; R = G / A; M = A / C). Таким образом, для гена RdPd можно синтезировать два разных прямых праймера, четыре разных обратных праймера и восемь различных зондов. Всего существует 64 возможных комбинации праймеров и зондов!

В документе Кормана-Дростена также указывается третий ген, который, согласно протоколу ВОЗ, не прошел дальнейшей валидации и не был признан ненужным:

«Следует отметить, что анализ N-гена также показал хорошие результаты, но не подвергался дальнейшей интенсивной проверке, поскольку был немного менее чувствителен».

Это было досадным упущением, так как лучше всего было бы использовать ПЦР всех трех генов в качестве подтверждающих анализов, и это привело бы к почти достаточному протоколу диагностического инструмента обнаружения вирусной РНК. Три подтверждающих этапа анализа по крайней мере минимизируют ошибки и неопределенности на каждом этапе складывания в отношении «шатких» пятен. (Тем не менее, протокол все равно не соответствовал бы любой «хорошей лабораторной практике», если учесть все другие ошибки проектирования).

В его нынешнем виде, к сожалению, анализ N-гена не предлагается ни в рекомендации ВОЗ (рис. 1) в качестве обязательного и важного третьего подтверждающего шага, ни в документе Кормана-Дростена как важный необязательный аргумент «для рутинного рабочего процесса». (Таблица 2).

Следовательно, почти во всех испытательных процедурах во всем мире использовалось только 2 совпадения праймеров вместо всех трех. Такой надзор делает весь протокол испытаний бесполезным с точки зрения предоставления точных результатов испытаний, имеющих реальное значение в продолжающейся пандемии.

Рисунок 1: Подтверждающий анализ N-гена не подчеркивается как необходимый третий шаг в официальной рекомендации ВОЗ по протоколу Дростена-Кормана, приведенной ниже [8], и не требуется как решающий шаг для повышения точности теста в публикации Eurosurveillance.

1c) Ошибочное содержание GC (обсуждается в 2c вместе с температурой отжига (Tm))
1г) Обнаружение вирусных генов

ОТ-ПЦР не рекомендуется для первичной диагностики инфекции. Вот почему тест ОТ-ПЦР, используемый в повседневной клинической практике для обнаружения COVID-19, не рекомендуется для диагностики COVID-19 на нормативной основе.

«Клиницисты должны осознавать повышенную точность и скорость молекулярных диагностических методов для диагностики инфекций, но также понимать их ограничения. Лабораторные результаты всегда следует интерпретировать в контексте клинической картины пациента, и для получения надежных результатов необходимы соответствующее место, качество и время сбора образцов». [9]
Однако его можно использовать, чтобы помочь врачу в дифференциальной диагностике, когда он или она должен различать различные инфекции легких (грипп, Covid-19 и SARS имеют очень похожие симптомы). Для подтверждения диагноза конкретного вируса необходимо применить не менее 3 специфических пар праймеров для обнаружения 3 вирусспецифических генов. Предпочтительно, чтобы эти гены-мишени располагались в вирусном геноме на максимально возможном расстоянии (включая противоположные концы).

Хотя в статье Кормана-Дростена описаны 3 праймера, эти праймеры покрывают лишь примерно половину генома вируса. Это еще один фактор, который снижает специфичность обнаружения интактной РНК вируса COVID-19 и увеличивает количество ложноположительных результатов тестов.
Следовательно, даже если мы получим три положительных сигнала (т.е. три пары праймеров дают 3 разных продукта амплификации) в образце, это не доказывает присутствие вируса. Лучшая конструкция праймера должна иметь концевые праймеры на обоих концах вирусного генома. Это связано с тем, что будет охвачен весь вирусный геном, и три положительных сигнала могут лучше различать полный (и, следовательно, потенциально заразный) вирусный геном от фрагментированного вирусного генома (без инфекционной активности).Чтобы сделать вывод об инфекционности вируса, нужно было включить ген Orf1, который кодирует основной фермент репликазы вирусов SARS-CoV (рис. 2). Позиционирование мишеней в той области вирусного генома, которая наиболее сильно и вариабельно транскрибируется, является еще одной слабостью протокола.

Kim et al. демонстрируют высоко вариабельную 3'-экспрессию субгеномной РНК в Sars-CoV-2 [23]. Эти РНК активно отслеживаются как сигнатуры для бессимптомных и неинфекционных пациентов [10]. Весьма сомнительно проводить скрининг популяции бессимптомных людей с помощью праймеров кПЦР, которые имеют праймер-димер из 6 пар оснований на 3 основных концах праймера (рис. 3).
Видимо ВОЗ рекомендует эти праймеры. Мы протестировали все производные колебания бумаги Кормана-Дростена с помощью инструмента для создания димерных материалов фирмы Thermofisher [11]. Прямой праймер RdRp имеет гомологию 3 п.н. с Sarbeco E Reverse. При высоких концентрациях праймера этого достаточно, чтобы создать неточности.

Примечание: один из праймеров N идеально соответствует клиническому патогену (Pantoea), обнаруженному у пациентов с ослабленным иммунитетом. Обратный праймер также поражает Pantoea, но не в той же области (рис. 3).

Это серьезные ошибки проектирования, поскольку тест не может различить вирус целиком и вирусные фрагменты. Тест нельзя использовать в качестве диагностики SARS-вирусов.

Рисунок 2: Относительное положение мишеней ампликонов на коронавирусе SARS и геноме нового коронавируса 2019 года. ORF: открытая рамка считывания; RdRp: РНК-зависимая РНК-полимераза. Цифры под ампликоном - это положения генома согласно SARS-CoV, NC_004718 [1];

Рисунок 3: Тест с помощью инструмента для создания димеров праймеров от Thermofischer показывает, что прямой праймер RdRp имеет 3'-прайм-гомологию 6 п.н. с Sarbeco E Reverse (левое поле). Другой тест показывает, что существует идеальное соответствие одного из N-праймеров клиническому патогену (Pantoea), обнаруженному у пациентов с ослабленным иммунитетом (правое поле).

2. Температуры реакции

2а) Температура плавления ДНК (> 92 °).
Адекватно рассмотрено в статье Кормана-Дростена.
2б) Температура амплификации ДНК.
Адекватно рассмотрено в статье Кормана-Дростена.
2c) Ошибочные данные GC и Tm

Температура отжига определяет, при какой температуре праймер прикрепляется / отсоединяется от целевой последовательности. Для эффективной и специфической амплификации содержание GC в праймерах должно соответствовать минимум 40% и максимуму 60% амплификации. Как показано в таблице 3, три праймера, описанные в статье Кормана-Дростена, не находятся в пределах нормального диапазона для содержания GC. Два праймера (RdRp_SARSr_F и RdRp_SARSr_R) имеют необычные и очень низкие GC-значения 28% -31% для всех возможных вариантов колебательных оснований, тогда как праймер E_Sarbeco_F имеет GC-значение 34,6% (Таблица 3 и вторая панель Таблицы 3) .

Следует отметить, что содержание GC в значительной степени определяет связывание с его конкретной мишенью из-за трех водородных связей в спаривании оснований. Таким образом, чем ниже GC-содержание праймера, тем ниже его способность связываться с его конкретной последовательностью гена-мишени (т. Е. С геном, который должен быть обнаружен). Это означает, что для распознавания целевой последовательности мы должны выбрать температуру, которая как можно ближе к фактической температуре отжига (значение наилучшей практики), чтобы праймер не отслоился снова, и в то же время специально выбрать целевая последовательность.

Если значение Tm очень низкое, как это наблюдается для всех шатких вариантов обратных праймеров RdRp, праймеры могут неспецифично связываться с несколькими мишенями, снижая специфичность и увеличивая потенциальные ложноположительные результаты.

Температура отжига (Tm) является решающим фактором для определения специфичности / точности процедуры qPCR и важна для оценки точности протоколов qPCR. Рекомендация по передовой практике: оба праймера (прямой и обратный) должны иметь почти одинаковое значение, предпочтительно одинаковое значение.

Мы использовали свободно доступное программное обеспечение для создания праймеров Primer-BLAST [12, 25], чтобы оценить лучшие практические значения для всех праймеров, использованных в статье Кормана-Дростена (таблица 3). Мы попытались найти значение Tm, равное 60 ° C, при этом аналогичным образом искали максимально возможное значение GC% для всех праймеров. Максимальное различие Tm 2 ° C внутри пар праймеров считалось приемлемым. Тестируя пары праймеров, указанные в статье Кормана-Дростена, мы наблюдали разницу в 10 ° C по отношению к температуре отжига Tm для пары праймеров 1 (RdRp_SARSr_F и RdRp_SARSr_R). Это очень серьезная ошибка, которая делает протокол бесполезным в качестве специального диагностического инструмента.

Дополнительное тестирование показало, что только пара праймеров, разработанная для амплификации N-гена (N_Sarbeco_F и N_Sarbeco_R), достигла адекватного стандарта для работы в диагностическом тесте, поскольку она имеет достаточное содержание GC и разницу Tm между праймерами (N_Sarbeco_F и N_Sarbeco_R). ) составляет 1,85 ° C (ниже критического максимума разницы в 2 ° C). Важно отметить, что это ген, который не тестировался в вирусных образцах (таблица 2) и не использовался в качестве подтверждающего теста. Помимо сильно изменяющихся температур плавления и вырожденных последовательностей в этих праймерах, существует еще один фактор, влияющий на специфичность процедуры: dNTP (0,4 мкМ) в 2 раза выше, чем рекомендуется для высокоспецифичной амплификации. В реакционную смесь также добавляют дополнительное количество сульфата магния. Эта процедура в сочетании с низкой температурой отжига может привести к неспецифическим усилениям. Если для количественной ПЦР требуется дополнительное количество магния, следует дополнительно изучить специфичность анализа.

Описанные здесь ошибки проектирования настолько серьезны, что маловероятно, что конкретная амплификация генетического материала SARS-CoV-2 будет происходить с использованием протокола статьи Кормана-Дростена.

Таблица 3: GC-содержание праймеров и зондов (адаптировано из статьи Кормана-Дростена; аберрации от оптимизированного GC-содержания выделены. Вторая панель показывает список всех значений передовой практики Primer-BLAST для всех праймеров и зондов, используемых в статья Кормана-Дростена, подготовленная профессором д-ром Ульрике Каммерер и ее командой

3. Количество циклов амплификации.

Следует отметить, что нигде в статье Кормана-Дростена нет упоминания о положительном или отрицательном результате теста или о том, что определяет положительный или отрицательный результат. Эти типы вирусологических диагностических тестов должны основываться на СОП, включая подтвержденное и фиксированное количество циклов ПЦР (значение Ct), после которых образец считается положительным или отрицательным. Максимально надежное значение Ct составляет 30 циклов. Выше Ct 35 циклов следует ожидать быстрого увеличения числа ложных срабатываний.

Данные ПЦР, оцененные как положительные после 35 циклов Ct, совершенно ненадежны.

Ссылаясь на Jaafar et al. 2020 [3]: «При Ct = 35 значение, которое мы использовали для сообщения о положительном результате ПЦР,